随着高龄高危孕妇比例增加和辅助生殖技术的蓬勃发展,近年来,双胎妊娠的出生率从 2.2 % 增长到 3.0 % ,增加了双胎妊娠产前筛查和产前诊断的复杂性和难度。 近年来随着分子遗传技术的飞速发展,无创产前检( non - invasive  prenatal  test,  NIPT) 等技术受到越来越多的关注和应用。NIPT 检测流程较为复杂,其质量控制影响因素较多,其中胎儿游离 DNA( cell - free DNA, cfDNA)浓度与 NIPT 的准确性密切相关,为保证 NIPT 的准确性,cfDNA 浓度至少达到 4 % 的最低检测浓度标准 。 研究团队对首都医科大学附属北京妇产医院产前诊断中心进行NIPT的双胎妊娠孕妇就诊及测序数据进行回顾性分析,评价双胎妊娠孕妇进行 NIPT 的 cfDNA 浓度可能存在的影响因素。

研究对象与方法
研究对象
回顾性研究 2019 年 1 ~ 12 月于首都医科大学附属北京妇产医院就诊,接受NIPT的3900例孕妇临床信息,其中双胎妊娠孕妇 244 例,单胎妊娠孕妇 3656 例。
依据本实验室 NIPT 的质控标准,当检测样本 cfDNA 浓度 < 3. 5% 时,判断为不合格,经过孕妇知情同意后进行二次采血检测。当二次采血检测 cfDNA 浓度≥3. 5% ,判为合格,并以二次采血样本作为检测对象进入之后测序数据分析;当二次采血检测 cfDNA 浓度 < 3. 5% ,判为检测失败,无法得出准确测序数据分析结果。
研究方法

分组回顾性整理归纳双胎/单胎妊娠孕妇NIPT检测的筛查年龄、采样孕周分布,分析不同筛查年龄、采样孕周的双胎/单胎妊娠孕妇 cfDNA浓度的差异。

采用SPSS17.0及Graphpad Prism 7. 0 统计学软件对数据进行统计分析和做图;计数资料以例数( n) 及百分比(% ) 表示,定量资料用均数 ± 标准差( x ± s) 表示; 组间比较采用 χ2 检验、t检验,以 P < 0 . 05 为差异有统计学意义。
研究结果

研究对象基本特征

依据本实验室 NIPT 的质控标准,排除连续两次检测 cfDNA 浓度 < 3. 5% 的样本,即入组分析双胎妊娠孕妇241例和单胎妊娠孕妇对照3639例。 

双胎妊娠孕妇平均筛查年龄为 31. 72 ±3. 45 岁,平均采样孕周为15. 30 ± 1. 94 周,平均 cfDNA 浓度为 8. 84% ± 3. 96% ;

单胎妊娠孕妇平均筛查年龄为 33. 14 ± 3. 73 岁,平均采样孕 周 为 16. 19 ±2. 94 周,平均 cfDNA 浓度为 8. 45% ± 3. 50% (表 1) 。

双胎妊娠孕妇中筛查年龄 25 ~ 29 岁、30 ~ 34 岁占比较高,分别为 66 例(27. 39% ) 和119 例(49. 38% );

单胎妊娠孕妇对照组 30 ~ 34 岁、35 ~ 39 岁占比较高,分别为1482 例(40. 73% )和1369 例(37. 62% )。

双胎 / 单胎妊娠孕妇,采样孕周均集中在12 ~ 19周,16 ~ 17 周占比最高,分别为 96 例 ( 39. 83% ) 和1022 例(28. 08% ) 。

年龄对cfDNA浓度的影响
以不同年龄分组,20 ~ 24 岁、25 ~ 29 、30 ~ 34 岁、35 ~ 39 岁和≥40 岁年龄组的双胎妊娠孕妇与单胎的 cfDNA 浓度比较差异均无统计学意义 ( P > 0 . 05 ,图 1 )。

孕周对 cfDNA浓度的影响
以不同采样孕周分组,12 ~ 13 周、14 ~ 15 周和≥20 周组的双胎与单胎妊娠孕妇的 cfDNA浓度比较差异均无统计学意义( P>0.05 ),
16~17周、18 ~ 19周组的双胎妊娠孕妇 cfDNA 浓度高于同组单胎( P<0. 05 ,图 2 )。

双胎 / 单胎妊娠孕妇 NIPT 建库成功率对比

244 例双胎妊娠孕妇中,7 例因cfDNA浓度 < 3. 5%首次采血建库检测不合格,其成功率为 97. 13% 。经知情同意后对首次采血建库不合格孕妇行二次采血建库,4例检测成功,其成功率为 57. 14% 。
3656例单胎妊娠孕妇中,34 例因cfDNA浓度<3. 5% 首次采血建库检测不合格, 其成功率为99. 07% 。 经知情同意后对首次采血建库不合格孕妇行二次采血建库,17例检测成功,其成功率为50. 00% 。

双胎妊娠孕妇NIPT首次采血建库成功率低于单胎(P < 0. 05) ,单胎妊娠孕妇 NIPT首次采血建库成功的可能性高于双胎;
双胎妊娠孕妇二次采血建库成功率与单胎比较,差异无统计学意义( P > 0. 05 ) ;双胎与单胎妊娠孕妇NIPT总体成功率比较,差异无统计学意义(P > 0. 05,表 2) 。

讨论

NIPT检测流程较为复杂,因采样失败、cfDNA 浓度低、生物信息学等测序数据质控不合格等均能造成检测失败。 其中 cfDNA 浓度是影响 NIPT 检测的成功率和准确性重要因素。孕妇外周血中 cfDNA,是因胎儿细胞通过胎盘进入母体血循环被母体免疫系统破坏,致其 DNA 以游离的形式存在于母体外周血中。
根据本研究数据分析显示, 双胎妊娠孕妇NIPT检测筛查年龄不同于单胎,主要集中在 25 ~ 34岁,而单胎妊娠孕妇的筛查年龄主要集中在 30 ~ 39岁。 虽然双胎 / 单胎妊娠的筛查年龄分布不同,但不同筛查年龄组双胎妊娠孕妇的 cfDNA 浓度与单胎比较差异无统计学意义,除外≥40 岁组,其他不同年龄组 cfDNA 浓度均可达到 8% 以上,25 ~ 29 岁组其 cfDNA 浓度均值达到 9% 以上。
除个体差异外,一般来讲 孕妇外周血中cfDNA浓度会随着其孕周增加而增加,与采样孕周呈正相关。

本研究中,NIPT 检测双胎、单胎妊娠采样孕周均集中在12 ~ 19周,其中16 ~ 17周占比最高;在不同采样孕周,双胎妊娠孕妇 cfDNA 浓度均高于单胎孕妇,在不同采样孕周组的 cfDNA 浓度均已经达到 8% 以上,达到 4% 的单胎最低检测浓度标准的2倍以上,且当采样孕周为 18 周及以上时,其 cfDNA浓度均值达到 10% 以上,为单胎妊娠的同孕周组近1. 25 倍。
双胎妊娠孕妇 cfDNA 个体差异较大,可根据其临床指征,对双胎妊娠孕妇的 NIPT 筛查年龄及孕周做出适宜选择,适当提前 NIPT 筛查年龄、延后采样孕周,以减少因 cfDNA 浓度不足造成 NIPT 的检测失败。

注：
1、参考文献：李珊珊,张萌,王威,王昕,陈玉娇,阴赪宏,王一鹏.年龄及孕周对双胎妊娠孕妇胎儿游离DNA浓度的影响[J].医学研究杂志,2022,51(1):46-4954
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