感染性疾病严重危害人类生命健康，快速准确检测病原体是有效治疗和精准防控感染性疾病的关键环节。传统的病原学检验技术覆盖的微生物种类少，难以满足临床需求。宏基因组高通量测序技术 (metagenomic next-generationsequencing，mNGS) 可以不基于假设、无偏倚地检测疑似感染患者标本中的病原微生物，扩大病原体检测种类，缩短检测时间，提供可用于患者诊断、制定治疗方案的关键信息，有效提升感染性疾病的诊疗水平，助力抗菌药物合理应用；还有助于解决新发、罕见、疑难病原体的漏检问题。mNGS在很大程度上提高了临床疑难危重感染、罕见和新发病原体感染的诊断水平和救治能力。在个体化医疗需求的大背景下，新技术的实验室自建检测能够持续提高临床诊治水平。
2024年1月，由中国药师协会、中华医学会细菌感染与耐药防治分会、国家卫生健康委临床抗微生物药物敏感性折点研究和标准制定专家委员会在《中华预防医学杂志》联合发表了《病原宏基因组高通量测序临床本地化检测规范专家共识》 (下文简称：共识)。

实验室自建检测 (laboratory developed test，LDT) 是指实验室自行研发、确认，仅限于本实验室使用的检测技术。近年来，随着检测技术的创新和发展，一些前沿技术如基因测序、质谱分析和流式细胞术等快速从基础研究向临床转化，并展现出良好的应用前景。

2021年国家药品监督管理局发布的《医疗器械监督管理条例》中指出，对国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需要，可以自行研制，在执业医师指导下在本单位内使用。2022年以来，北京、上海、广州、杭州多地陆续发布了LDT试点政策，探索LDT具体实施方案。

由于mNGS覆盖病原体种类多、临床验证难度大、验证周期长，使得常规IVD产品注册较为困难。为满足临床需要，本共识在实验室符合国家相关政策法规以及保证检测方法性能可靠的前提下，对如何在本地开展mNGS检测提出具体指导意见。从mNGS实验室建设基本要求、湿实验和干实验流程的搭建、mNGS的性能确认、临床诊断性能评价、mNGS的质量管理，到mNGS 推荐使用的人群、时机和疾病、mNGS标本的选择及采集、报告解读、LDT项目备案与管理等方面，均提出了规范要求和建议。
一、mNGS实验室建设基本要求

mNGS在实验环节中根据是否使用聚合酶链式反应 (PCR) 构建文库，可分为PCR建库与PCR-free建库两大类型，两者在实验室空间要求上有所差异。

1) 基于PCR建库：在符合PCR要求的实验室中开展，防止核酸扩增产物造成的实验室污染。

2) 基于PCR-free建库：可在同一个空间内设置试剂准备区、标本处理区 (配备生物安全柜) 和建库测序区 (PCR-free建库、文库纯化、等量混合、上机测序)，但仍然需要警惕人员操作等带来的气溶胶污染可能性，在一个相对独立的空间进行qPCR法文库浓度测定。

mNGS所检测的微生物涉及范围广泛，实验操作应该在具备至少生物安全二级 (BSL-2) 资质的实验室中进行，并按照生物安全相关要求进行操作。如果处理可疑高致病性病原体的标本，须满足更高要求的行业标准和规范的要求。

mNGS实验设备和器材应能满足湿实验、干实验和质量控制需求。由于mNGS相较传统PCR有更高的病原体覆盖范围和防污染要求，在保证实验质量的前提下优先采用经性能确认的封闭式自动化设备代替部分人工操作，有利于避免实验过程中来自操作人员和实验室环境中的微生物或其核酸造成的污染。

1) 根据每天处理的标本数量，实验室应配备具有相应专业背景并能满足需要的工作人员，包括：湿实验应由具备分子生物学检验专业技能的人员，如分子生物学检验专业检验技师操作；干实验需要配备生物信息研发及管理人员，以保证分析流程、持续更新、性能确认、维护及管理；结果审核应配备具有临床感染病学相关知识的微生物检验医师。

2) 针对疑难报告，建议成立mNGS报告解读团队，由具备临床感染病学、临床微生物检验学、临床分子生物学、生物信息学等相关专业知识的人员组成。

3) 所有人员均须通过岗位相关的培训和考核，并进行定期能力评估方能上岗。

实验室在正式开展实验前应对mNGS的全流程检测方法进行选择和性能确认，特别对影响检测结果的核心要素，包括但不限于：标本核酸提取方法、是否去宿主核酸以及去宿主核酸方法、是否富集微生物核酸以及富集方法、建库方法、测序方法、最小测序数据量确认、生物信息分析算法、数据库选择、背景核酸识别方法、新发病原体识别方法等，以满足方法符合率、交叉反应、精密度、准确度、检出限、抗干扰能力 (如针对高人源标本)、稳定性等性能参数的要求。

实验室要进行严格的筛选和充分的数据验证，以求得到最佳的临床检测效能。经确认的检测方法和实验参数需要进行标准文件化管理，并由实验室的技术质量负责人和项目负责人共同确认后实施。方法学参数如有变更需进行验证后再应用于临床标本检测。

湿实验流程是指对待测标本进行前处理、核酸提取、文库构建、高通量测序，以获得核酸测序数据的实验室操作环节。湿实验流程按操作方式分为手工操作和自动化操作。根据检测病原体核酸的类型，实验室可分别建立脱氧核糖核酸 (DNA) 和核糖核酸 (RNA) 湿实验流程

为提高mNGS检测的敏感性，可考虑在标本前处理过程中对病原体或其核酸进行富集，可选择正向富集法与反向富集法两类。

1) 正向富集法以PCR富集和探针捕获为代表，属于核酸提取后的富集方式。

2) 反向富集法即去宿主技术，包括差速离心、差异化裂解、甲基化抗体处理等流程。

病原核酸富集需要结合标本类型、项目预期用途综合考虑检测性能、成本、操作时效性以及对目标病原体可能造成的损失和偏好性，在开展性能确认后再予以使用。

核酸提取分为核酸释放与纯化两个主要步骤。

1) 核酸释放方法包括物理法 (机械研磨、超声破碎等)、化学法 (十六烷基三乙基溴化铵法或十二烷基磺酸钠法等)、酶裂解法等，不同方法的核酸释放效果有差异。实验室需要综合考虑不同方法对不同病原体核酸的释放效果，寻找最佳平衡点保障核酸提取的效率。以物理释放法为例，破壁时长 (循环次数)、破壁强度以及微珠材质和粒径都是应考虑的因素。为提升释放效果，可采取物理、化学、酶解等多方法联合使用。

2) 核酸纯化一般采用磁珠法或柱法两种，建议对纯化后的核酸浓度、纯度进行测试以满足后续建库的要求。

核酸提取和纯化若使用手工操作，应考虑不同标本类型的差异、不同核酸提取试剂盒的提取效率、纯度以及片段大小等因素；若使用自动化核酸提取仪系统，需要综合考虑检测通量、自动化程度、成本、核酸质量等因素。

DNA文库构建主要分为TA连接法建库与转座酶建库。RNA文库构建与DNA相比，最主要的差异在于逆转录步骤，在保证建库稳定性的前提下可考虑去除人核糖体RNA (占总RNA比例约85%~90%) 以提高RNA病毒的检测敏感性。

建库方法可分为手工法建库和仪器自动化建库，实验室在选择方法前需对核心技术环节 (如标签、接头的连接) 质量进行评估，主要质量指标包括单/双标签测序，连接效率等。此外还应考察建库前核酸投入量的下限和上限，确保取得的文库在核酸插入片段的大小分布上满足所使用的高通量测序仪、测序模式和读长，以及后续生信分析对片段大小的要求。

测序仪与配套试剂、耗材通常为封闭一体化设计。实验室按照所选购设备的操作说明书进行相关操作。在选择测序仪时，要综合考虑兼容性、测序通量、测序时间、碱基判定的准确性、成本等因素。为降低标签跳跃带来的假阳性，宜使用双标签测序模式。

mNGS生物信息分析涉及算法、软件和数据库，需要基于临床预期用途及可能的日常检测标本量计算所需要的服务器性能，保证下机数据能够在预期时间内完成分析。

1) 如有条件，建议实验室优先使用本地服务器 (注：数据存储在院内) 进行数据的存储和管理，数据存储、访问、下载、分析等均应符合国家对医学数据管理的要求。

2) 若选择云端分析系统 (注：数据存储在云端)，由于测序数据中含有患者的遗传信息，需要与服务提供商针对数据访问、使用、披露、中止、修改的权限与机密性达成书面协议。实验室必须确定数据存储的数量、媒介、位置和储存时限，数据的传输过程中应设置只读访问，防止被篡改。

1) 原始数据的存储与传输：实验室应确定原始测序数据及FASTQ文件在服务器上存储的位置，并明确具备唯一标识的统一命名，便于数据调用与快速分类查找。

2) 数据预处理：实验室可通过FASTQC和MultiQC等软件查看测序数据质量、总数据量、碱基质量值 (Q20和Q30) 等，结合测序芯片泳道上生成的簇密度设置质控点判断本批次数据能否用于后续分析。

3) 过滤宿主序列：为了提高微生物数据的分析时效性，需要去除测序数据中的宿主序列，通常方法是把比对到人类基因组的序列进行过滤。真菌和寄生虫与人类的基因组序列有一定的同源性，在过滤宿主序列的过程中需要评估运行时间、去除效率与非特异性去除 (非人源序列而被错误过滤) 的序列比例。

4) 物种注释：物种注释是病原宏基因组检测最核心的内容之一，主要是将通过质量控制的非宿主序列与微生物参考数据库比对，或者经过从头组装成contigs/scaffolds后再比对到微生物参考数据库，确定在特定序列相似性阈值 (如≥97%) 下的物种分类级别。目前可用的注释工具分为三类：DNA-to-DNA比对工具、DNA-to-Protein 比对工具、基于特征标记基因的比对工具。有研究表明，在mNGS中，DNA-to-DNA工具往往比DNA-to-Protein工具能够更好地进行物种分类，但DNA-to-Protein工具在识别新发和高度可变的基因序列时敏感性更高。而在以注重物种丰度的微生物组学分析中，则推荐使用基于特征标记基因的比对工具。

5) 参考数据库：微生物参考数据库的选择显著影响物种注释分类的结果。在构建、使用和管理这类数据库时需要重点关注以下问题：(1)充分评估数据库的全面性以及纳入物种在分类学上的代表性；(2)无论所选参考基因组的来源如何，实验室都需要通过重测序或其他技术手段确认其注释的准确性，序列的完整性，避免纳入错误注释、命名错误或代表性不足的微生物序列；(3)病原体 (尤其是RNA病毒) 在自然状态下是不断发生变异的，所以需要及时 (或定期) 对参考数据库中的基因组信息进行更新及验证。

6) 读长归一化：mNGS检测到的微生物常以读长数作为结果，但它受测序量、标本质量等因素的影响，并且同张芯片不同文库分配的下机数据量会有波动，所以有必要对读长进行归一化处理。建议将每百万测序读长中匹配到某一微生物基因组的特异读长 (RPM) 作为归一化指标。

7) 版本控制：为了保证每批次临床标本结果的可溯源性及可重复性，实验室需要明确每一次测试所使用的软件及数据库的版本。

当生物信息学分析流程建立后，需对其进行性能确认。主要性能指标，包括准确率、精确率、召回率和F1-Score (即精确度和召回率的调和平均值) 等。

确认mNGS湿实验和干实验全流程对病原体的检测能力是否能够达到临床预期用途。

在全流程性能确认中至少应包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、分枝杆菌、丝状真菌、酵母菌、DNA病毒、RNA病毒、寄生虫，同时应关注胞内菌和难破壁的病原微生物。

建议实验室mNGS检测系统应对方法符合率、交叉反应、精密度、准确度、检出限、抗干扰能力 (如针对高人源标本)、稳定性等性能参数进行确认。

1) 样品盘要包含模拟参考品和已知病原检测结果的真实临床标本。

2) 样品盘的设置应严格遵循临床预期用途所涉及的标本类型，所含微生物应有代表性，尽可能覆盖预期用途中的病原体。标准微生物菌株可以选用ATCC或CMCC菌株等。

3) 应根据不同标本类型来合理地设置模拟参考品中的人源细胞浓度 (如支气管肺泡灌洗液的人源细胞浓度中位数为105 cells/ml)。

4) 模拟参考品中应至少包含革兰阳性菌、革兰阴性菌、丝状真菌、酵母、DNA病毒、RNA病毒、寄生虫共7类病原微生物。

5) 在制备模拟参考品前，针对所有待投入微生物进行最低检出限 (limit of detection，LoD) 研究并确认是否能满足预期用途中对检测性能的要求。

* (五) ～ (十一) 方法符合率、交叉反应、精密度、准确度、检出限、稳定性、抗干扰性

临床有效性包含敏感性和特异性。敏感性是指参考方法检测结果为阳性的标本中，mNGS得到相同阳性结果的比例。敏感性低则意味着会出现较多漏检 (假阴性)。特异性指参考方法检测结果为阴性的标本中，mNGS得到相同阴性结果的比例，特异性低则意味着会出现较多假阳性结果。

1) 在完成mNGS的分析性能确认后，需要使用真实标本进行临床检测效能评估。

2) 参考方法包含微生物培养、病理检测、免疫学检测、PCR、一代测序等。

3) 临床检测性能评价主要采用观察性研究。

4) 在评价某些罕见的病原体，阳性病例的数量有限，可以引用文献报道的临床敏感性和特异性作为理论支撑。实验室可采用“代表性病原体”进行临床诊断性能评价。

mNGS质量管理的目的是规范分析前、分析中和分析后三个阶段质量控制，确保mNGS检测报告的质量。

1) 分析前质量控制涉及标本采集和送检流程，标本前处理流程，试剂耗材的批次、分装、储存时间以及设备的维护等环节，需对上述环节设置质控点进行监控；

2) 应建立标本采集与送检流程以明确标本选择、采集时机和方式、容器/耗材、标本量、送检单填写规则、运送保存条件、拒收标准等，以减少环境和人体定植微生物或其核酸污染，同时考虑标本保存运输的稳定性；

3) 应建立临床标本的标准化前处理程序，对标本性状和运输容器/时长/温度等建立明确的接收和拒收标准；

4) 应建立试剂、耗材的批次、分装、储存时间以及设备的维护等流程质控标准，以保障关键试剂和关键设备的稳定性和有效性。

分析中质量控制涉及核酸提取、文库建立、测序生信分析等众多环节。涉及的质控点包括：

1) 核酸提取的质控标准，如核酸浓度、纯度、完整性等；

2) 文库质控标准，如建库前核酸投入量下限与上限、文库核酸浓度、纯度、片段大小分布；

3) 测序数据建立标准，如文库有效数据量、Q30值、接头比例、内参序列 (人工合成双链DNA序列或使用噬菌体，与待测病原体基因组没有同源性) 的检出等；

4) 明确室内质控 (阴性、阳性质控品) 的在控和失控标准，每次测序需要包括阴性和阳性质控品。

1) 分析后质控涉及报告周转时间、阳性率/阴性率、室内质控失败率、报告修改率、与临床诊断的一致率、复测率、取消测试数等数据的记录、统计和分析；

2) 对异常记录提供纠正措施以不断改进和优化流程，并审查所有与检测相关的文档；

3) 各实验室应定期进行室间质评或能力验证，在检测流程有重大调整，或更换核心试剂耗材时需要再次进行性能确认。