胎儿游离DNA的起源和应用

2024.02.28 责任编辑:陈醒 阅读量:255

什么是胎儿游离DNA
1969 年,相关研究首次报道母体外周血循环中存在胎儿细胞,由于母体中胎儿有核红细胞含量极低,富集和分离操作复杂,因此基于胎儿细胞的研究至今仍处于探索阶段。
1997 年 Lo 等通过鉴定 43 例孕妇外周血中含有男性胎儿的 Y 染色体序列,首次证实母体血浆中存在 胎儿有利DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)。
进一步研究证实了 cffDNA 源自胎盘滋养层细胞,以高度片段化形式释放到母体循环血中,最早可以从孕 4 ~ 5 周的母体外周血中检测到,孕 7 周后 cffDNA 稳定存在,且浓度随着孕周的增加而增加,同时 cffDNA 半衰期短,产后数小时在母体循环中清除[1]至此,cffDNA登上世界舞台,成为无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)的热点。
胎儿游离DNA的应用
胎儿染色体非整倍体的无创产前检测
胎儿遗传或新发的单基因疾病( ingle-gene disorder,SGD) 发生率较高,早期检测显得尤为重要。胎儿一半基因组来自于父亲,另一半基因组与母亲共享。来自父亲的遗传信息属于“外源性”遗传信息,只能由胎儿基因组提供,不受母体背景的影响,因此可以通过检测母体外周血循环中是否存在父系来源的致病变异来推断胎儿基因型,这种分析策略被称为存在/不存在原则。应用存在/不存在原则可以成功检测父系来源的常染色体显性疾病、新发突变以及父母携带不同的致病变异的常染色体隐性疾病的胎儿遗传状态。单基因病 NIPT 早期的临床应用主要是检测父系遗传的常染色体显性疾病和新发突变,或有医学指征的胎儿性别鉴定,软骨发育不全是首个进入 NIPT 临床实践的单基因病病种[2]。
胎儿染色体非整倍体的无创产前检测
胎儿染色体非整倍体是产前诊断最重要的目标疾病,从 cffDNA 发现伊始,大量研究人员利用孕妇外周血中的 cffDNA 探索胎儿染色体数目异常的检测方法。
2008 年 NGS 技术首次应用于胎儿染色体非整倍体的产前诊断,此后多数研究表明,NGS 可分辨孕妇外周血中唐氏综合征胎儿和正常核 型 胎 儿 21-三体总量的微小差异,对21-三体综合征( trisomy 21,T21) 胎儿的检出率达到99. 7% ,13-三体综合征( trisomy 13,T13) 胎儿的检出率达到 99. 0% ,18-三体综合征( trisomy 18,T18) 胎儿的检出率达到 97. 9% [3]。
2011 年胎儿常见染色体非整倍体的 NIPT 首次引入临床应用,凭借其无创、高准确率、孕周限制小等优势,NIPT 在全球大范围展开应用,其临床应用价值被充分证明。
在中国陆军军医大学第二附属医院进行的的一项基于8152 名孕妇的21、18和13染色体非整倍体的筛查结果发现:T21 的阳性预测值(positivepredictive value,PPV) 约为 65% ~ 94%,T18的 PPV 为 47% ~ 85% ,T13 的 PPV 为 12% ~ 62% ,无论在高风险和低风险人群中都具有较好的检测效能[4]。
胎儿染色体结构异常的无创产前检测
母体拷贝数变异( copy number variants,CNVs)是导致胎儿染色体微缺失微重复综合征( microdeletion and microduplication syndromes,MMs)的一个主要原因,约有41%的CNVs 是致病性或可能致病性变异[5],可导致智力障碍、自闭症谱系 障碍等神经发育异常。产前超声筛查对 MMs 漏诊率高,传统的核型检测无法分辨小于 5 ~ 10Mb 的 CNVs。 研究人员早在 2011年就尝试利用 NIPT 筛查胎儿基因组的染色体 CNVs 并获得成功[6]。
相关研究结果表明,采用随机捕获序列(custom target capture sequences, TACS) 驱动的靶向捕获富集技术、NGS 结合多引擎生 物信息学分析技术对胎儿基因组染色体 CNVs 进行了 无创检测,这种新的 NIPT 技术正确识别了胎儿基因组中所有微缺失,表现出 100% 的敏感度和特异度。
无创产前胎儿性别鉴定
关于人的性染色体,男性为XY,女性为XX。而X连锁遗传病是一种致病基因位于X染色体上的遗传病。若是致病基因位于X染色体上,随着X染色体在上下代之间传递,称为X连锁遗传病或伴性遗传病。
基于男女性染色体的特点,对于女性来说,有两条X染色体,致病基因呈显性时,杂合子发病;致病基因呈隐性时,杂合子不发病,仅仅属于携带者。男性仅一条X染色体,另一条为Y染色体,因此,不管致病基因呈显性或隐性,只要X染色体上存在致病基因,便会发病。在超声检查最早在孕12周后才能鉴定胎儿性别,而通过检测孕妇外周血中的胎儿游离DNA是否存在Y染色体特异性基因片段[常用SRY或DYS14(定位于TSPY1)],则可以最早在孕7周就进行胎儿性别的鉴定。该技术的适用人群之一是X-连锁隐性遗传基因携带孕妇,当男性胎儿为携带者时,100%发病。
如果在cffDNA中检出SRY/DYS14,则为男性胎儿,需进一步行侵入性产前诊断明确胎儿是否携带致病基因;如为女性胎儿,即使为携带者,也不会发病,无需行产前诊断,从而避免与之相关的流产风险[7]。
无创产前胎儿RhD血型鉴定
人类 Rh 血型系统是临床最重要的血型系统之一,根据红细胞上D抗原的有无分为RhD阳性和RhD 阴性。RhD阴性孕妇若曾有输血、流产、妊娠史者,当怀有 RhD 阳性胎儿时易引起胎-母血型不合。RhD血型不合所致的新生儿溶血症病情凶险,常常引起胎儿死亡,或新生儿核黄疸,给患儿遗留智力和运动障碍。因此,新生儿 RhD 血型的出生前诊断对 RhD 阴性孕妇的孕期监测和新生儿溶血病的预防和治疗具有重要意义。
传统的胎儿产前诊断是依靠从绒毛或羊水中获得胎儿DNA,然后对胎儿组织DNA进行基因扩增,该方法为侵入性取材,有引起胎儿流产以及加重RhD阳性胎儿病情的危险。
近年来,陆续有报道孕妇血浆中存在胎儿游离DNA,为非侵入性产前诊断胎儿RhD血型提供了理论依据。
与胎儿性别鉴定原理类似,通过检测孕妇外周血中是否存在RHD基因片段(外显子5和7)即可判断胎儿Rh血型:当外周血中检出相应的RHD序列时,提示胎儿为RhD阳性;反之,胎儿为RhD阴性。
通过实时荧光定量PCR技术对RHD基因进行扩增,最早在孕11周即可鉴定胎儿血型,敏感度高99.83%;而在孕23周后,敏感度上升至100%[8]。
无创产前亲子鉴定
产前亲子鉴定,也称胚胎期亲子鉴定,是指通过提取胎儿DNA从而获得基因信息,再与被检父的基因信息进行比对,从而确认被检父与胎儿之间是否具有亲生血缘关系。比较常见的样本为孕妇羊水、胎儿绒毛等。但这种侵入式取材很有可能会伤及孕妇和胎儿。并且,司法部已经明确规定正规司法鉴定机构不能开展产前亲子鉴定,2016年司法部颁布的《司法鉴定程序通则》第十五条规定,“鉴定机构对发现鉴定材料不真实、不完整、不充分或者取得方式不合法的,鉴定用途不合法或者违背社会公德的案件均不得受理”。同年,《司法部办公厅关于规范司法鉴定机构开展亲子鉴定业务有关工作的通知》中第二条第三款明确规定:“司法鉴定机构不得接受当事人委托对孕妇开展产前亲子鉴定或者进行胎儿性别鉴定”。
由于cffDNA的发现,利用新一代DNA测序技术对母体外周血中的游离DNA片段,包含胎儿游离DNA,进行测序、生物信息分析,从中得到胎儿的遗传信息,并与疑似父亲的DNA信息进行比对,实现确认亲子关系,这种方法安全、可靠、高效、准确。
但是,如果想做无创产前亲子鉴定,还是要选择具有相关资质,拥有自主实验室的正规机构进行产前无创亲子鉴定。
总结
孕妇血浆中的cffDNA进行的更为安全的产前诊断分析方法在近几年得到了飞速的发展,已经应用于多种遗传疾病的临床检测、性别鉴定以及无创产前亲子鉴定。
但是在经济成本、检测手段、检出率及可检测的病种范围上目前仍存在诸多局限性,如怀有女性胎儿的孕妇仍无法得到可靠的产前诊断,胎儿 DNA 丰度扩增技术有待继续改进,分子检测标志物的丰度、完整性和特异性仍有限,胎儿多基因病的相关研究也有待加强。
随着未来科技水平、医疗水平和经济水平的不断发展,cffDNA有望在产前无创筛查、诊断以及亲子鉴定行业中稳步发展,从而更好地为需要的孕妇提供服务。
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DNA鉴定

根据孟德尔遗传定律(亲子鉴定的理论基础),孩子身上的遗传物质一半来自于生物学父亲(简称“生父”),一半来自于生物学母亲(简称“生母”),每个基因座上的两个等位基因也分别来自生父和生母。DNA亲子鉴定就是根据科学技术将子女的DNA信息与父亲、母亲的DNA信息相比对,如果符合即是亲生关系,不符则非亲生。

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