蓝沙前沿分享|基因编辑技术在疾病治疗中的应用和挑战

2024.06.14 责任编辑:陈醒 阅读量:68

基因编辑是一种对生物体基因组特定位点进行精确修饰的技术,通过对基因片段的敲除、插入及替换,实现对生物体某一特性或性状的改变。基因编辑技术主要包括锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALEN)、规律性重复短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/cas endonuclease,CRISPR/Cas)系统。
ZFN编辑技术[1]
锌指蛋白是上世纪80年代由科学家在非洲爪蟾的转录因子中发现,后逐步发展完善成为较早的一类人工编辑基因组的技术。ZFN由特异识别DNA的锌指蛋白和FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域两部分构成,是一种人工合成的融合蛋白。将人工设计产生的锌指蛋白与非特异性FokⅠ剪切结构域结合形成具有活性的二聚体,即可对目标基因进行特异剪切。ZFN作为第一代被广泛使用的基因剪切工具,在小鼠、大鼠、斑马鱼及人类细胞中的技术建立已经较为成熟。2003年,科学家成功地利用该技术对果蝇和人类细胞的基因进行编辑。但是由于ZFN的设计复杂,构建时间长并且成功率低,不能广泛的被实验室掌握,因此该技术的发展与应用在一定程度上受到了阻碍。
TALEN技术
随着对基因编辑技术的深入研究,TALEN技术逐渐取代了ZFN技术,成为第二代基因编辑技术。TALENs核酸酶是由特异识别结合DNA的TALE蛋白和FokⅠ核酸内切酶融合组成。TALE蛋白是一类从植物病原菌黄单胞菌属分离出的效应蛋白,识别靶标序列,同样地利用限制性核酸内切酶FokⅠ对基因组进行编辑。2009年,Moscou和Bogdanove发现了TALE蛋白特异识别并结合DNA的作用机制。2011年,Sander等将改造的Tale蛋白与FokⅠ核酸内切酶构建了TALEN技术,并证实其能定向修饰基因组。此后,有大量实验证明该技术在人类细胞、小鼠、大鼠、斑马鱼等不同物种均适用。与ZFN相比,在识别靶序列的特异性上,TALEN更具优势。此外,TALEN的毒性低,蛋白设计也相对简单,因而成为基因治疗研究中的有力工具。但是,其重复序列多,工作量大,在实验室广泛应用仍存在困难。
CRISPR/Cas技术
CRISPR/Cas技术是第三代基因编辑技术,开启了基因编辑技术领域的新篇章。CRISPR/Cas系统是一种适应性免疫系统,通过靶向DNA或RNA来保护微生物免受外来核酸(如噬菌体)的侵袭,约50%的细菌种类和迄今为止几乎所有的古细菌物种都有这种系统。该系统的显著特征是在基因组上含有CRISPR array序列,由富含AT的前导序列和串联重复序列组成,这些串联重复序列又被序列特异的间隔隔开。CRISPR/Cas系统抵抗外源DNA入侵。CRISPR/Cas系统通过三个阶段介导适应性免疫(免疫和防御):首先,适应阶段,当病毒或其他外来遗传物质入侵时,细菌将部分外源的DNA捕获并整合到CRISPR array的串联重复序列中,形成新的间隔序列。其次,表达阶段,将CRISPR array转录并加工成单独的crRNA,每个crRNA带有病毒或质粒的RNA片段以及CRISPR重复序列的一部分成为成熟的crRNA。第三,干扰阶段,crRNA引导Cas蛋白的复合物或单个Cas蛋白对入侵者进行切割,最终达到免疫的效果。
CRISPR有很多变化,而且CRISPR/Cas系统也具有广泛的自然多样性,包括靶向DNA的系统、靶向RNA的系统以及同时靶向DNA和RNA的系统。CRISPR/Cas系统也以不同的方式运行,通过各种效应子-crRNA复合物介导的不同机制识别和切割其核酸靶点。根据其独特的效应蛋白,CRISPR/Cas系统目前分为6种类型(Ⅰ~Ⅵ),又分为两大类:1类系统(TypeⅠ、TypeⅢ和TypeⅣ型)使用多个Cas蛋白复合物来实现免疫应答,2类系统(TypeⅡ、TypeⅤ和TypeⅥ型)利用单个核酸酶Cas效应子进行免疫应答。例如属于TypeⅡ型系统的Cas9,只需要Cas9蛋白即可与成熟的crRNA组装成RNP复合物对DNA进行切割。2013年,CRISPR/Cas技术正式用于DNA编辑修饰中。与前两种基因编辑技术相比,该技术的构建成本更低、操作更加便捷、编辑效率也更高效。其不断地研究发现为生物学及临床应用领域的发展带来了巨大变革,在基因治疗领域具有广阔的应用前景。

应用:

1、基因编辑在呼吸系统疾病治疗中的应用
氧化应激可导致肺纤维化引起呼吸疾病。通过CRISPR/Cas9技术在细胞实验中已证明低聚原花色素对非小细胞肺癌细胞(A549)中过氧化氢诱导的氧化应激起到保护作用。实验发现,低聚原花色素刺激的A549细胞中改变了Nrf2的表达。Nrf2是对氧化还原反应敏感的转录因子,可以引起其下游靶基因在转录水平和蛋白质水平上的变化。通过CRISPR/Cas9技术敲除Nrf2可以消除Nrf2与抗氧化反应元件ARE的结合,从而消除了低聚原花色素介导的针对过氧化氢诱导的氧化应激的保护作用。研究表明在A549细胞的抗氧化反应中低聚原花色素通过Nrf2-ARE途径起重要作用,这项研究为呼吸疾病的治疗提供了理论依据。
而且在临床试验中CRISPR/Cas9技术已经开始作为肺癌的干预手段。该试验主要对PD-1的功能进行了研究。PD-1只能在活化的T细胞中表达,该基因可促进细胞的凋亡,是临床上的一个免疫检查点。当PD-1被敲除时会延长T细胞的存活时间,这是因为T细胞周期检查点被抑制所导致,引起活化的T细胞的存活时间延长。通过CRISPR/Cas9技术敲除PD-1基因后,血液中活化的具有免疫功能的T细胞数量明显增加,以此来抑制肿瘤生长。此次试验中,通过收集病患自体来源的T细胞(外周血液中),利用CRISPR/Cas9技术将PD-1基因敲除而丧失基因功能,再通过扩增筛选出已敲除PD-1的T淋巴细胞,并将其分批回输患者身体中,通过观察临床效果发现敲除PD-1基因对肺癌有抑制作用。
2、AIDS和白血病治疗中的应用
CRISPR/Cas9技术已广泛应用于哺乳动物细胞基因组的体外编辑。尽管这种方法显示出潜在的临床实用性,并且已经开始进行临床试验以探索基于CRISPR疗法的安全性和可行性。有研究表明,G蛋白偶联因子超家族成员CCR5基因是治疗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)感染的理想靶点,因为CCR5缺失的血细胞对HIV-1进入具有很大的抗性。2019年,Xu等利用CRISPR/Cas9技术,在人体造血干细胞上进行CCR5基因编辑,实现了基因编辑后的成体造血干细胞在人体长期稳定的造血系统重建,初步证明了CRISPR/Cas9治疗AIDS和白血病的可行性和在人体内的安全性。该研究将经CRISPR/Cas9编辑的CCR5敲除后的供者来源的CD34+成体造血干细胞移植到患有HIV-1感染和急性淋巴细胞白血病的患者中。在之后19个月的观察中未发现基因编辑造成的脱靶及其他不良反应。之后为了进一步探索治疗的有效性,对该患者短暂停止服用抗人类免疫缺陷病毒药物。在此期间,CCR5基因编辑的T细胞表现出一定程度抵御人类免疫缺陷病毒感染的能力。目前,虽然人们已经实现了CRISPR编辑的造血干细胞的成功移植和长期植入,但淋巴细胞中CCR5破坏率仅约为5%,这表明还需要进一步进行研究。
3、其他疾病治疗中的应用
2018年,Long等利用CRISPR/Cas9技术对杜氏肌营养不良症患者机体的多能干细胞进行改造,使其产生了健康的心肌。2017年,Liao等报道利用CRISPR/Cas9在糖尿病小鼠体内募集转录激活复合物,实现顺式表观遗传学修饰,介导基因转录活化的组蛋白修饰状态,从而实现内源基因的激活。利用该体系可在肝脏内成功激活内源PDX1表达,使其分泌胰岛素。Chen等发现,酸敏感离子通道1参与了前列腺癌细胞酸介导的信号通路,并且在前列腺癌细胞中表达升高,通过CRISPR/Cas9系统敲除酸敏感离子通道1可以显著降低前列腺癌细胞的侵袭能力和去势抵抗性。汪超甲等利用CRISPR/Cas9表达载体敲除了在神经胶质瘤细胞中高表达的Pyk2,抑制了胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,揭示了其在胶质瘤发生过程中的作用,为治疗胶质瘤提供了理论基础。Rubio等利用CRISPR/Cas9系统在干细胞中针对神经系统疾病相关基因TSC2与KCNQ2进行靶向灭活。TSC2与结节性脑硬化相关,KCNQ2与家族性先天性癫痫有关。

批准信息:

2023年,Intellia Therapeutics的NTLA-2002获得欧盟孤儿药资格认定,NTLA-2002是一种治疗遗传性血管性水肿的研究性体内 CRISPR基因组编辑疗法。同年,福泰制药Vertex与CRISPR Therapeutics合作开发的CRISPR基因编辑疗法Casgevy在英国获得批准(见图6),这是全球首个获得批准的CRISPR/Cas9基因编辑疗法。CASGEVY含有通过CRISPR/Cas9在BCL11A基因的红细胞特异性增强子区域进行离体编辑的人类造血干细胞和祖细胞,该疗法适用于12岁以上且出现复发性血管闭塞危象的镰状细胞病(SCD)患者,以及输血依赖性β地中海贫血症(TDT)患者。Vertex称在CASGEVY治疗SCD和TDT的两项全球临床试验中,试验达到了各自的主要目标,即至少连续12个月不需要输血或摆脱严重血管闭塞危象。

面临挑战

1、安全问题
基因治疗技术仍处于起步阶段,目前的研究对基因组的了解仍然非常有限。基因编辑技术仍然需要大量的工作来提高其准确性,并确保发生在基因组一部分的变化不会引起其他区域的变化,从而避免不可预见的后果。另一个问题是,一旦植物或昆虫等生物被转基因,它们将很难与野生类型区分开来,这可能会危及生物多样性,一旦释放到环境中。基因治疗技术仍处于起步阶段,对基因组的了解仍然非常有限。这项技术仍然需要大量的工作来提高其准确性,并确保发生在基因组一部分的变化不会引起其他区域的变化,从而避免不可预见的后果。另一个问题是,一旦植物或昆虫等生物被转基因,它们将很难与野生类型区分开来,这可能会危及生物多样性,一旦释放到环境中。
2、伦理问题
1、在技术层面,基因编辑技术的伦理问题在于技术上尚不完善,可能导致应用过程中的诸多不确定性。
①准确率不足导致的“脱靶效应” 
②编辑效率低下产生的“嵌合效应” 
③CRISPR/Cas9系统进入人体内导致的“免疫效应” 
④编辑特定功能性基因导致的不可预知的“副作用”
2、在社会层面,基因编辑技术可能会对社会公平与正义产生冲击,导致社会发展伦理问题的出现。例如,基因编辑手段可能加剧社会中存在的偏见和狭隘,加剧家庭观念及共同利益的冲击,动摇技术的平等获取和社会正义[2]。
3、在生态层面,基因编辑技术可以改变物种的基因库,带来不可控的风险后果。例如,基因编辑所带来的“多代效应”后果难以评估,可能会人为增加人类出现遗传问题的风险;在农业领域的应用可能会对生态环境产生不良影响,损害整体的自然生态,人为定向基因选择可能会导致基因的多样性消失;基因编辑食品所涉及的食品安全和监管,以及间接引发的法律规制等问题。
3、费用高昂
即使许多临床试验已经验证了基因治疗的有效性和安全性,基因治疗的高额费用依然是限制基因编辑技术造福更多患者的主要因素。有相关统计结果,全球获批的几款基因治疗药物定价均超过270万美金。
24.04-8.jpg 115.7 KB
参考文献
[1]董田玉,刘远远,段思琦,等.基因编辑技术在疾病中的应用及研究进展[J].国际呼吸杂志, 2021, 41(8):5.DOI:10.3760/cma.j.cn131368-20201026-00972.
[2]王前,刘洪佐.机体哲学视域下基因编辑技术的伦理反思[J].伦理学研究, 2020(2):6.DOI:CNKI:SUN:YJLL.0.2020-02-017.

返回上页
意见反馈

类型

联系方式

内容

DNA鉴定

根据孟德尔遗传定律(亲子鉴定的理论基础),孩子身上的遗传物质一半来自于生物学父亲(简称“生父”),一半来自于生物学母亲(简称“生母”),每个基因座上的两个等位基因也分别来自生父和生母。DNA亲子鉴定就是根据科学技术将子女的DNA信息与父亲、母亲的DNA信息相比对,如果符合即是亲生关系,不符则非亲生。

蓝沙生物依托自主研发的多项国家专利技术,向广大社会公众提供准确、可靠的亲子关系鉴定服务。蓝沙实验室采用高通量测序技术,并配备市面先进检测设备;为确保结果的准确性,实施了包含样本质检、生产质检、报告质检三层质检流程,结合生物信息分析与计算机数据分析技术,对检测过程进行严格的质量监控和比对,确保每一位客户都能得到精确可靠的鉴定结果。