文献共读:宏基因组测序技术在感染性病原体检测中的应用进展

2024.01.15 责任编辑:陈醒 阅读量:200

宏基因组测序技术(mNGS)是对待测样本中的全部核酸成分进行“鸟枪法”大规模平行测序,再将测序数据进行生物信息学分析,以获取样本中完整的核酸序列信息的技术。
现如今,该技术被越来越多地应用于临床,在感染性病原检测、病原生物学特征中展现了独特的技术优势和广阔的应用前景。
本文将对宏基因组测序技术在感染性疾病病原体检测中的应用进行阐述,旨在进一步揭示宏基因组测序在感染性疾病诊治中的重要作用和应用价值。

01 宏基因组测序技术
宏基因组测序

宏基因组测序是一种直接从患者标本中进行泛核酸检测的方法,该方法可对样品中所有的核酸进行放大和并行测序,允许无差别检测所有微生物( 如细菌、病毒、寄生虫和真菌) 、抗体、毒力因子及宿主生物标志物等。
实验流程
mNGS 技术的实验流程分为湿实验和干实验,
其中湿实验包括核酸提取、文库构建、上机测序;
干实验包括生信分析与报告解读,不同的临床样本在核酸提取之前需要进行不同的预处理,比如组织块的研磨、痰液液化、体液离心等以提高病原体检出率。
mNGS优势
(1)无需病原体培养,可直接对临床标本进行检测;
(2)检测通量高,在一次检测中可获得标本中病原微生物的全部遗传信息;
(3)敏感度高,丰度较低的微生物也可检出;
(4)通过宏基因组测序可分析病原体多样性、种群结构、进化关系等,解读其与环境、宿主之间的相互联系。
应用现状
现mNGS已凭借其技术优势应用于包括呼吸系统感染、中枢神经系统感染及血液系统感染等在内的多种感染性疾病的诊治中。目前绝大多数医院未建立宏基因组测序平台,而是借助第三方服务。从临床需求来看,医院自建平台和第三方提供检测服务都在发展。2020年底我国相继出台了《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原 体的临床应用专家共识》和《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》,其中就mNGS的临床应用范围、样本采集、报告解读、诊断效能以及质量保证等方面进行了证据总结和意 见推荐,以促进mNGS在感染性疾病领域的普及和规范化发展。

02 mNGS在感染性疾病上的应用
细菌性感染
宏基因组测序在诊断细菌性感染方面可有效做到以下几点:
(1)宏基因组测序有更高的阳性检出率。
(2)宏基因组测序技术可“无偏倚”地检测目标样本中几乎所有的核酸信息,以此来探究样本的菌群结构。
(3)细菌的药敏试验需要对病原菌进行分离,操作复杂且耗时,无法了解苛养菌的 耐药信息。宏基因组测序技术既可以对病原微生物进行鉴定,也可以通过比对抗性基因数据库分析其耐药表型。
由此可见,无论是在病原菌阳性检出率、多重感染的鉴定以及细菌耐药鉴定等方面,mNGS相比于传统培养技术均表现出更佳的优势。
病毒性感染
在病毒性感染检测方面, 宏基因组测序可有效做到以下几点:
(1)可有效检出未知及罕见的病原体类型。
(2)可在没有病毒靶标富集的情况下诊断合并感染,从而更及时地在疫情爆发早期对可疑感染患者病情进行鉴别诊断以及对患者进行分类。
(3)通过宏基因组测序鉴定病毒基因组可追踪病毒与感染性疾 病之间的联系。
相对于传统病毒检测方法,mNGS不仅可解决其在病毒合并感染、罕见及新型病毒检测上的困难,也有效弥补其在追踪病毒来源问题上的不足。
其他感染
除了细菌、病毒外,mNGS同样运用到其他种类的感染性病原体如真菌、支原体、衣原体、立克次体、寄生虫等。宏基因组测序在寄生虫方面研究较少,未来的研究方向包括寄生虫的基因组特征以及寄生虫对肠道微生态环境的影响等

03 mNGS的挑战
高背景人源宿主核酸的干扰

mNGS可检测临床样本中所有的核酸序列,宿主基因组信息在不同的临床检测样本中都有不同程度的占比,因此mNGS分析产生的巨大数据集 中只有一部分可以用于病原体的鉴定,影响检测的灵敏度。

样本、试剂以及实验环境的污染
在常用的DNA提取试剂盒和其他实验室试剂中,外源DNA普遍存在,影响结果判读,特别是微生物载量低的样本。

测序成本高
序列数据的产生方面成本已有很大降低,但是相比传统的检测方法,用于宏基因组测序的仪器和试剂价格均较高。

病原体基因组数据库不完善
有的生物信息数据库未能囊括所有病原微生物,有可能导致漏检。目前常用的数据库有提供细菌、古菌以及真菌基因组的SILVA数据库和RDP数据库,提供病毒序列最全面的NCBI-NT数据库等。

质量控制与评价的指南缺乏
mNGS技术流程包含多个步骤,因此需要科学严谨的质量控制与评价方案来保证其质量的稳定从而满足临床需求。

综合 以上关于mNGS优劣所述,在以下几种情况推荐使用 mNGS对感染性疾病进行诊断:
(1)多次传统微生物检测查阴性,但又有明显感染症状的患者可使用mNGS进行检测,以克服部分病原菌难培养、罕见及新型病 毒检测难的障碍。
(2)针对多重感染情况,结合实际情况可优先考虑使用mNGS。
(3)针对疑难重症,感染原因未知及诊断复杂的情况下,利用mNGS可全面解读病原微生物构成,分析患者主要病因。
(4)临床医 生如需了解病原体的丰度、多样性、功能结构及进化关系等以解读病原体与宿主和环境间的关系时,推荐使用mNGS。

结语
综上,相比传统的检测手段,mNGS有无可替代的优势,但 mNGS无法摆脱其技术本身的局限性,无法 解决所有与病原体检测相关的问题。同时,这一行业发展仍处于发展初期,提供检测服务的第三方企业较多,应加紧制定规范化、系统化的标准,以利于市场整 体的发展和临床诊疗的正确实施。
未来,随着 mNGS 相关质量标准确立、自动化程度逐渐提升、成本进一步降低,mNGS的临床应用会更加成熟与广泛。在感染性疾病病原体的检测、细菌耐药基因的检测、病原微生物毒力基因 的检测、菌株分型、微生物进化等方面会有更加突出 的贡献。
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