实体瘤患者ctDNA的个性化监测方法

2024.03.04 责任编辑:陈醒 阅读量:114

研究背景
手术切除肿瘤后的临床监测方法主要依赖于影像学检查或利用血清肿瘤标志物。然而,影像学检查的灵敏度和准确性有限,对较小的肿瘤的筛查非常困难。血清肿瘤标志物对于病理诊断同样存在许多局限性,许多因素会影响这类标志物的表达水平。为了进一步提高癌症的临床治疗效果,需要使用更高灵敏度和准确性的生物分子标志物来尽早地监测微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)和复发风险。
与其他分子检测方法相比,基于二代测序尤其是使用分子标签(unique molecular indexes,UMIs)的ctDNA检测方法,可以纠正文库扩增和测序过程中引入的错误,具有更高的准确性(accuracy)和灵敏度(sensitivity)以及更低的检测下限(limits of detection,LOD)。
锚定多重PCR技术(anchored multiplex PCR, AMP)则能够对突变位点进行链特异性评估,使突变检测更加可靠。与传统的PCR扩增比较,AMP降低了扩增偏好,对目标区域的覆盖更加均匀。
一些研究表明,相比于追踪单个驱动突变(driver mutation),同时追踪多个突变可以提高ctDNA检测的灵敏度(sensitivity)和特异性(specifcity),使用患者个性化Panel(patient-specifc panel,PSP)也比传统的固定化Panel(fixed somatic variant panels)具有更低的LOD和更高的检测特异性(specifcity)。
在该研究中,研究人员建立了一种基于肿瘤组织突变特征的( tumor informed )、泛癌实体瘤患者外周血中ctDNA的长期监测方法( Invitae Personalized Cancer Monitoring assay),这种监测方法采用了UMIs和AMP构建测序文库,并应用了高通量测序技术,研究人员同时进行了一系列测试评估这种监测方法的性能。
研究方法
Invitae Personalized Cancer Monitoring Assay 的检测流程:
分成全外显子组测序(WES)和ctDNA检测两部分。将患者的肿瘤和对照样本进行WES检测,同时测序分析相同患者的肿瘤和正常组织样本,该检测方法选取50个肿瘤特异性体细胞突变设计患者的个性化Panel (patient specifc panel,PSP),利用PSP对患者血浆中的cfDNA进行杂交捕获,采用了UMIs和AMP构建测序文库,对目标区域进行高深度测序,并使用降噪算法检测ctDNA。参考不同肿瘤类型的指南建议,按照一定的时间节点采集患者的外周血进行检测分析,可以持续监测患者外周血中的ctDNA。
WES检测的性能评估:包括分析的准确性( accuracy)、检测下限( limit of detection,LOD)、空白检测限( limit of blank,LOB)、可重复性(reproducibility)以及精度( precision)。
ctDNA检测的评估:包括准确性、LOD、可重复性以及精度。
头对头的测试:验证不同cfDNA投入量、文库构建批次以及测序设备对检测结果的影响。
WES检测和个性化Panel设计方法:Invitae Personalized Cancer Monitoring Assay将肿瘤组织样本和对照组织样本进行WES检测,测序数据使用BWA-MEM比对到GRCh37/hg19参考基因组,检出的突变包括SNVs和indels,从对照组织样本中识别到的种系突变、CHIP或嵌合种系突变将被过滤掉,从而识别肿瘤特异性体细胞突变。测序数据的QC包括测序深度(要求肿瘤样本的平均覆盖深度≥150x,对照样本的平均覆盖深度≥20x)以及报告的性别与患者实际性别一致。每个个性化Panel均使用专有算法生成,并对所选择的体细胞突变进行严格质量控制,AF小于5%或AF疑似有问题的突变将被过滤掉,还要考虑突变检出的错误率、设计探针与突变之间的编辑距离以及突变周围的区域是否存在影响突变检出的序列。个性化Panel最多可以包括50个体细胞突变。
ctDNA检测方法:ctDNA检测的QC包括使用SNP判断肿瘤样本、对照样本和血浆样本都来自同一个体(identity QC);覆盖目标体细胞突变的测序深度必须达到≥10,000(术前基线检测阈值)和≥30,000(术后监测检测阈值),当Panel包括的突变数量不足50时,需要适度调整阈值( sequencing reads QC);使用噪声模型和离群AF进行过滤(variant QC)。实际检测突变的read数与所有监测突变的read数,将进行单尾泊松检验,术前基线检测阈值p < 0.01判定为ctDNA阳性,术后监测检测阈值p < 0.001 判定为ctDNA阳性。
研究结果
结果一:WES检测的性能验证
该研究首先对Invitae Personalized Cancer Monitoring Assay方法的WES检测部分进行了性能验证。研究人员对118例样本进行了全外显子测序分析,包括113例患者样本(其中有56例肿瘤组织样本和19例恶性血液病的骨髓样本,其余38例为对照组织样本)、2个参考样品(NA24385和NA12878)和3个SeraSeq样品(Tumor Mutation DNA AF Mix, Tri-Level Tumor Mutation DNA Mix, and Myeloid Mutation DNA Mix),这些样本一共构建了603个测序文库,其中99.3%的测序文库达到了≥150×的平均覆盖率。
1、评估WES检测的准确性:
检验WES检测的患者临床样本中,有69例肿瘤样本(50例FFPE肿瘤组织样本和19例骨髓样本)在前期已经进行过详细的研究,可以用来评估WES检测突变的灵敏度,其中有4例样本已知是全阴性的,其余65例样本存在7609个突变。对这些样本的全外显子组测序一共检测到7594个突变,灵敏度为99.8%(7594/7609)。有15个突变没有被检测到,这些突变通常位于低覆盖区域,并且还有一些的突变具有非常低的AF,因此没有在分析流程中报出。为了进一步评估WES检测的灵敏度和特异性,研究人员还对NA12878参考样品进行了WES检测,并将检测到的突变与Genome in a Bottle提供的高可信度突变基准进行了比较,NA12878参考样品的测试结果显示,WES检测的灵敏度>99.9%,特异性>99.9%
2、评估WES检测的肿瘤细胞含量下限:
WES检测过程中的一个检测下限(Limit of Detection,LOD)是设计个性化Panel所需的肿瘤细胞含量(tumor content)下限。研究人员使用了7例肿瘤含量≥20%的肿瘤样本以及7例与之相匹配的对照正常组织样本,评估了肿瘤细胞含量的LOD。为了模拟肿瘤细胞含量低于20%的样本,研究人员使用来自同一患者的正常组织DNA对肿瘤DNA进行了稀释,构建了14个肿瘤细胞含量为~15%和~7.5%的人为稀释样品。接下来对于7例肿瘤组织样本和14个稀释样品的DNA进行建库,将DNA投入量分别设置为50ng、100ng和200ng三个梯度,进行了三次重复,正常组织样本的DNA也进行了相同投入量的建库,并进行了两次重复,一共231个WES测序文库
7个肿瘤样本中有2个具有非常少的体细胞突变,无法设计个性化Panel。研究人员使用其余5个肿瘤组织样本以及对应的人为稀释样品(共计135个文库)评估了不同肿瘤细胞含量设计Panel的成功率。肿瘤细胞含量≥20%的样本,检测出足够体细胞突变并设计Panel的成功率为100%(63/63);肿瘤细胞含量为10-20%的样本,成功率为80%(24/30);肿瘤细胞含量< 10%的样本,成功率为54%(23/42)。研究人员发现,DNA投入量并没有对设计Panel产生影响,50 ng、100ng和200ng都具有比较接近的成功率(图2)。
3、评估WES检测的突变AF检测下限:
WES检测部分的另一个LOD是突变AF的检测下限。该研究使用了两组样本评估了突变AF的LOD:(1) 2个SeraSeq标准品(Tumor Mutation DNA AF Mix, Tri-Level Tumor Mutation DNA Mix, and Myeloid Mutation DNA Mix)的混合样品,这组混合样品具有4%、7%、5%、10%和15%的突变AF。(2) 7个将NA12878和NA24385按照10/90、20/80、30/70、50/50、70/30、80/20和90/10的比例进行人为混合的样品,这组混合样品具有5%、10%和15%的突变AF。
研究人员对第一组混合样品进行了三次重复的WES检测,对第二组混合样品进行了单次的WES检测。
对第一组混合样品的检测结果显示,对于AF≥10%的突变,WES检测的灵敏度为99.9%;对于AF为5-7%的突变,WES检测的灵敏度降低为93.3%。对第二组混合样品的WES检测结果也得出了非常相似的检测下限。
4、评估WES检测的突变检出空白限:
该研究同样对WES检测的突变检出空白限(Limit of blank)进行了评估,检验假阳性突变是否会被错误地用来设计Panel。研究人员使用30个癌旁正常组织样本来评估LOB,将同一个正常组织样本中的一部分假定为“肿瘤组织”,另一部分则假定为“正常组织”,人为创造了一个“肿瘤组织-正常组织”配对,这一过程重复了四次,最终产生了120对“配对样本”。对120个“配对样本”进行WES检测,最终只检出了3个有可能用于Panel设计的假阳性突变,假阳性率可以估计为0.05%(每个Panel包含50个突变,120个“配对样本”就是6000个,只误报了3个,因此假阳性率是3/6000=0.05%)。
5、评估WES检测的可重复性和精度:
研究人员使用了三个参考样品(Seraseq Tumor Mutation DNA AF Mix、Seraseq Myeloid Mutation DNA Mix和NA12878)评估了WES检测的可重复性和精度。评估可重复性的实验设计是由不同的操作员构建不同批次的测序文库并使用不同的测序设备进行WES检测,评估精度的实验设计则是由相同的操作员重复构建三个测序,并在单次测序过程中完成WES检测,根据检出突变的一致性来衡量WES检测的可重复性以及精度。测试结果显示,WES检测组分的重复性为98.91% (181/183个突变保持一致),精度为99.45% (182/183个突变保持一致)。
研究人员同时发现,突变检出的一致性会随着AF降低而逐渐降低,在AF在5%-10%的突变具有>95%的总体一致性,不同的突变类型中,SNV具有最高的总体一致性 (>99%),其次是duplication(~99%)、deletion (~96%) 和insertion(~93%)。
结果二:ctDNA检测的性能验证
该研究接下来对Invitae Personalized Cancer MonitoringAssay方法的ctDNA检测部分进行了性能验证。研究人员使用95例血浆样本(其中8例来自健康个体)和5个参考样品(NA24385、NA24149、NA24631、NA24694和NA24695)对该方法的ctDNA检测部分进行了性能验证。
为了评估ctDNA检测的准确性以及进行头对头比较,该研究对21例FFPE肿瘤组织样本和21例配对照组织样本进行了WES检测,并基于检测结果设计了个性化Panel,用来检测上述血浆样本和参考样品。
1、评估ctDNA的检测下限(LOD):
由于该研究获得的患者血浆样本有限,研究人员将NA24385的DNA片段加入到其他4个参考样品中(NA24149、NA24631、NA24694和NA24695)评估ctDNA检测的LOD。
研究将突变AF设置为0.003%-0.1%的不同梯度,DNA投入量设置为2ng-80ng的不同梯度,产生了48种组合方式,使用预先设计的个性化Panel对这48个样本进行检测,同时研究还将不同的操作人员、文库制备时间以及测序设备等差异考虑进去,一共构建了576个测序文库(表3)。
576个测序文库中有14个因为read数或覆盖度较低没有通过QC,研究对其余562个测序文库进行了概率分析,评估可以在95%以上的重复中报出的突变AF检测下限(LOD95)。结果显示,当突变AF为0.03%和cfDNA投入量为10ng的条件下,术前基线ctDNA检测的灵敏度>99.9%,对应的LOD是0.03%;当突变AF为0.008%和cfDNA投入量为60ng的条件下,术前基线ctDNA检测的灵敏度同样可以达到>99.9%,对应的LOD是0.008%(表4)。
对于一些突变负荷较小的肿瘤样本来说,有时很难达到设计Panel 所需50个突变位点的数量要求,因此该研究也评估了当突变数量从50个下降到18个所对应的LOD。突变AF为0.008%和cfDNA的投入量为60ng的条件下,18-50个突变数量的Panel对术前基线ctDNA检测的灵敏度都可以达到>99.9%,对应的LOD是0.008%。突变AF为0.05%和cfDNA的投入量为10ng的条件下,18个突变数量的Panel对术前基线ctDNA检测的灵敏度也可以达到>99.9%,对应的LOD是0.05%(图 4)。
2、ctDNA检测的准确性(Accuracy):
研究人员使用了4例已知突变AF的患者血浆样本和8例健康人的血浆样本。由于患者血浆样本有限,研究人员将患者血浆样本的cfDNA混入健康人的cfDNA,构建了36个具有不同突变AF的cfDNA样本(0.005%、0.008%、0.01%、0.05%和0.1%),使用包含50个突变位点的个性化Panel对这36个样本进行了检测,并将DNA投入量设置为10ng、25ng和60ng的梯度,并在构建文库时进行了三次重复,一共108个测序文库。在这些文库中,有一个文库由于没达到测序深度而没有通过QC,研究人员对剩余107个文库的ctDNA检测测试。
实际和预期的ctDNA检测结果见表4。8个健康人的血浆样本(即阴性对照)的检测结果都是ctDNA阴性。然而,在4个预期ctDNA阳性的文库中未检测到ctDNA,这可能是由于对应的10ng DNA投入量以及0.008%和0.01%的突变AF,已经低于检测的LOD(10ng的DNA投入量和0.03%的突变AF)。
基于这一结果,研究人员认为10ng的DNA投入量以及0.008%突变AF的条件下,该方法ctDNA检测的特异性是> 99.9%(8/8),灵敏度是95.7%((88/92)。
研究人员还使用32例已知ctDNA检测结果的临床血浆样本和8个已知为阴性的健康人血浆样本进行了ctDNA检测的准确性评估,所有40个样本的ctDNA检测结果均与预期的一致。
此外,为了测试该检测方法能否识别样本混用和样本污染,研究人员将个性化Panel和血浆样本进行了样本混用测试。结果显示,该检测方法能够根据患者特异性的SNP,成功地识别出血浆样本和设计Panel时所使用WES样本不匹配。
3、ctDNA检测的可重复性和精度:
研究人员使用与评估LOD的相同的48个人工样本评估了 ctDNA检测的可重复性和精度,这些样本具有与LOD接近的突变AF,范围0.003%-0.1%。
与评估WES检测的可重复性和精度类似,对于可重复性的实验设计是设置不同的操作员构建不同批次的测序文库并使用不同的测序设备进行ctDNA检测,一共构建了108个测序文库。对检测精度的实验设计则是由相同操作员重复制备了36个测序文库,并在相同测序设备上同时测序。
用于评估可重复性(n = 108)和精度(n = 36)所构建的144个文库均符合QC要求。
结果显示ctDNA检测的可重复性和精度分别为98.2%和97.2%。
结果三:头对头测试
该研究使用来自5名II 期或 III 期非小细胞肺癌患者的临床样本进行头对头测试(5例肿瘤组织样本、4例白细胞对照样本、1例正常组织对照样本和5例血浆样本),对Invitae Personalized Cancer Monitoring Assay从WES检测到ctDNA检测的整个流程进行评估。研究人员使用5个肿瘤组织样本与其对照样本构建测序文库,设置不同的操作员构建不同批次的测序文库,一共构建了30个肿瘤-对照测序文库。30个肿瘤-对照测序文库中有6个(来自同一个患者)在WES检测时没有检出足够的体细胞突变,无法设计个性化Panel,其余的24个肿瘤-对照测序文库则根据检出的体细胞突变分别设计了对应的个性化Panel,使用这24个个性化Panel以及4名患者的血浆cfDNA构建了cfDNA测序文库,将cfDNA的最大投入量设置为60ng,最小投入量设置为10 ng。ctDNA检测的实际结果与预期结果之间具有完全相同的一致性 (20/20)。
研究结论
1)本文建立的Invitae Personalized Cancer Monitoring Assay检测方法,具有比较稳健的灵敏度和特异性,即使cfDNA的投入量低至10ng,仍然可以准确地检测ctDNA。
2)对该方法ctDNA检测LOD的评估结果显示,使用60ng cfDNA的投入量以及18-50个突变位点设计的个性化Panel时,术前基线检测ctDNA的LOD可以达到0.008%。使用10ng cfDNA的投入量以及18个突变位点设计的个性化Panel时,术后监测ctDNA的LOD可以达到0.05%。
3)对样本肿瘤细胞含量LOD的评估结果显示,肿瘤细胞含量≥20%的样本构建个性化Panel的成功率可以达到100%,肿瘤细胞含量≥10%的样本的成功率也大于80%。
4)同时,对该方法的可重复性和精度评估结果显示,即使操作员、测序文库制备批次以及测序设备不同,该方法的ctDNA检测结果也具有较高的一致性。
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