肿瘤甲基化标志物研究进展2023年度盘点

2024.03.04 责任编辑:陈醒 阅读量:92

癌症是全球死亡的主要原因之一,早期发现可以降低所有类型癌症的死亡率。因此,可靠的肿瘤筛查标志物研究和开发至关重要。表观遗传修饰被定义为不涉及基础DNA序列变化的遗传性基因活性变化,这些修饰通过表观遗传因素微调基因表达程序,是控制细胞分化、胚胎发育等关键生物过程的主要分子机制,并且强有力的证据表明表观遗传重编程是癌症动态转录组异质性的驱动力。自首次在原发性人类肿瘤中识别出异常的DNA甲基化以来,大量研究表明,DNA甲基化的变化在肿瘤进展和转移中扮演着重要的角色。人类研究最为广泛的表观遗传修饰是DNA甲基化,DNA甲基化是发生在胞嘧啶核苷酸上的共价修饰,其中大部分发生在胞嘧啶后面跟着鸟嘌呤的位置(CpG位点),DNA甲基化也可以通过连续的细胞分裂在没有DNA甲基化维持的情况下被移除。CpG位点在基因组中并非随机分布,而是存在于CpG岛等富含CG的区域中,主要位于人类基因的调控区域 。CpG岛的甲基化是一种转录抑制的表观遗传机制。DNA甲基化的变化在癌症早期就能出现,而且DNA甲基化与癌细胞中大量的异常改变相关,基因启动子区域的超甲基化被认为具有致癌和影响预后作用。所以,DNA甲基化分析可有效识别具有临床意义的肿瘤甲基化标志物。近年来,诸如:全基因组重亚硫酸盐测序(whole-genome bisulfite sequencing,WGBS)、甲基敏感限制性内切酶测序(methyl-sensitive restriction enzyme sequencing,MRE-Seq)、简化的表观亚硫酸氢盐测序(reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)等高通量技术(high-throughput technologies)的出现加速并扩展了人们对肿瘤发生的表观遗传机制的认识,揭示了大量具有潜在价值的癌症特异性表观遗传标记或特征,这些标记或特征可用于肿瘤诊断、预后预测或其对治疗的反应评估。本文将探讨2023年对临床肿瘤学产生重大科研影响的肿瘤甲基化标志物,主要根据样本来源对这些标志物进行细致分类,旨在通过深入分析表观遗传生物标志物的发现和研究,揭示其在未来临床实践中的潜在应用价值。
01基于肿瘤组织检测的肿瘤甲基化标志物
1.1 消化系统肿瘤
由于DNA甲基化发生在肿瘤发展的早期,有研究通过DNA甲基化和基因表达的整合分析,并利用机器学习方法,揭示了胃腺癌潜在的诊断和预后甲基化特征标志。该研究使用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)胃腺癌数据,识别出差异甲基化位点(differentially-methylated positions,DMPs)和差异表达基因(differentially-expressed genes,DEGs),在443个肿瘤和27个非肿瘤STAD样本之间,共识别出256个DMPs,包括140个高甲基化和116个低甲基化位点;基因表达分析揭示了2 821个DEGs,其中上调1 247个,下调1 574个;通过分析甲基化对基因表达的顺式和反式调控影响,观察到甲基化和表达之间主要是负相关,而在高甲基化和低甲基化基因中,分别与基因表达主要呈现负相关和正相关。为了寻找诊断生物标志物,该研究进一步使用了位于27个下调基因启动子中的28个高甲基化探针,通过实施特征选择方法选出8个探针,包括cg17105014(GYPC)、cg23273897(MME)、cg22083047(PRICKLE2)、 cg01049530(BMP3)、cg18237405(CPNE5)、cg12741420(IRF4)、cg11754206(KCNB2)、cg09396217(ANGPT1)并基于此构建了一个诊断模型,在训练和验证(GSE30601,包括203个肿瘤和94个非肿瘤样本)队列中曲线下面积(area under the curve,AUC)分别达到0.99和0.97。在顺式调控的背景下,甲基化和基因表达之间存在普遍的负相关。该研究还观察到正常未甲基化的基因启动子 CpG 岛中 DNA 甲基化异常增加和相关基因沉默是癌症中最明显的表观遗传改变,而在反式调控中,高甲基化基因主要与基因表达呈负相关;但是,也有研究发现低甲基化基因更可能与基因表达呈正相关。总之,这些研究为胃腺癌引入了具有潜在应用价值的诊断和预后DNA甲基化标志物,但是需要进一步验证。
在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)和慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的鉴别诊断上,目前临床手段并不能有效区别,因此可能产生严重的后果。DNA甲基化标志物提供了一种分子标记手段可用于区分PDAC和CP,其通过机器学习方法和高级整合方法,识别出了可用于区分PDAC和CP的潜在生物标志物组合:cg03306374(PRKCB)和cg15506157(KLRG2),在验证队列中AUC达0.905,其中蛋白激酶C β型基因(protein kinase C beta type gene,PRKCB)的CpG岛中6个DNA甲基化位点在组织和患者血浆cfDNA中达到了100%的诊断准确率。因此认为,这些DNA甲基化标志物可能显著提高对疑似胰腺癌患者的诊断质量。
1.2 呼吸系统肿瘤
基于癌症相关甲基化信号的动态特征,DNA甲基化检测有望在经手术治疗的肺癌患者中检测微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)和作为术后随访指标。在基于甲基化的肺癌动态分析(methylation-based dynamic analysis for lung cancer,MEDAL)的患者队列中,通过对匹配肿瘤、肿瘤邻近组织和纵向血液样本进行了超深度靶向测序和亚硫酸盐测序分析,采用肿瘤相关的甲基化状态MRD(tumor-informed methylation-based MRD,timMRD)评估每个血液样本的甲基化状态,并在MEDAL队列(n=195)进行生存分析,同时在另一个研究肺癌术后ctDNA动态变化的临床独立队列DYNAMIC(n=36)中验证。结果显示,术后时间点timMRD评分较高的患者在MEDAL队列中展现出较短的无病生存期(HR=3.08,95%CI:1.48~6.42;P=0.002),在独立的DYNAMIC队列中也是如此(HR=2.80,95%CI:0.96~8.20,P=0.041)。以上研究进一步进行了多因素回归分析并确认术后timMRD评分是肺癌独立预后因素,而且与肿瘤相关的体细胞突变状态相比,timMRD评分在术后随访中识别复发患者的性能更佳,包括临床Ⅰ期等肿瘤负担较低的亚组以及在基线期循环肿瘤DNA(ctDNA)阴性状态的复发患者中更准确,与ctDNA突变预测的平均时间相比,timMRD评分在复发前120  d的阴性预测值为97.2%。这些基于外周血的动态甲基化分析研究,为术后癌症监测提供了一种很有前途的策略。
胸膜间皮瘤是一种罕见的恶性肿瘤,主要由石棉暴露引起。一项病例对照研究分析了恶性胸膜间皮瘤诊断前血液样本中的DNA甲基化特征,其嵌套于欧洲癌症和营养前瞻性调查(European prospective investigation into cancer and nutrition,EPIC)队列,旨在确定与恶性胸膜间皮瘤相关的DNA甲基化标志物。在EPIC队列中,该研究纳入了20年随访期间发生恶性胸膜间皮瘤的135例参与者的样本,以及135名匹配的无癌症对照样本;在发现阶段,该研究选择了在入组后5年内发生恶性胸膜间皮瘤的EPIC参与者(n=36)和匹配的对照,然后通过10倍交叉验证和相关分析筛选出9个差异甲基化CpGs:cg25755428 (MRI1)、cg20389709 (KLF11)、cg23870316、cg13862711(LHX6)、cg06417478(HOOK2)、cg00667948、cg01879420(AMD1)、cg25317025(RPL17)和cg06205333(RAP1A),通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析显示,基于基线特征(年龄、性别等)以及9个相关CpGs构建的模型对恶性胸膜间皮瘤的发生具有更好的预测价值,在诊断前5年以上的患者仍保持一定的性能(5年AUC为0.89,5~10年AUC为0.80,10年AUC为0.75,基线AUC范围:0.63~0.67)。该研究首次分析了作为非侵入性生物标志物的DNA甲基化标志物在恶性胸膜间皮瘤病例诊断前血液样本中的变化,其应用可提高对高风险石棉暴露者的识别,从而采取更密集的监测,以早期识别肿瘤。
1.3 泌尿系统肿瘤
DNA甲基化标志物高灵敏度的特征也使其成为指导前列腺癌检测的理想策略。前列腺癌的患病率与多种因素相关,包括年龄、遗传和种族等。表观遗传失调是原发性前列腺癌的特征。随着治疗手段的进步,患者寿命得到延长,但原发性前列腺癌向罕见部位(如大脑)转移现象也日益增多。一项研究在42例前列腺癌大脑转移(PCBM)的患者(其中17例有匹配的原发肿瘤)中进行DNA甲基化分析,以检查原发性前列腺癌与PCBM之间的表观遗传区别、表观遗传变化与突变背景之间的关联,以及与前列腺癌大脑转移相关的特定表观遗传变化,结果显示,前列腺癌大脑转移中的异常甲基化与突变背景和PRC2复合体活性相关,尤其在SPOP突变型前列腺癌大脑转移中特别明显。尽管前列腺癌大脑转移表现出CpG岛高甲基化表型,但该研究也观察到了涉及神经活性配体-受体相互作用和细胞黏附分子(如GABRB3、CLDN8和CLDN4)启动子的低甲基化,这表明原发肿瘤中的肿瘤细胞可能需要特定的重编程才能形成大脑转移。该研究有助于揭示前列腺癌大脑转移的DNA甲基化概况以及前列腺癌大脑转移相关异常DNA甲基化的潜在机制和影响。
02基于血液活检的肿瘤甲基化标志物
2.1 基于血液ctDNA的肿瘤甲基化标志物
近年来,甲状腺结节的发病率越来越高,因此对甲状腺恶性结节和良性结节进行准确分类尤为重要。然而,目前甲状腺癌诊断方法,包括超声检查和细针穿刺活检等手段的准确率仍较低。有研究开发了一种靶向DNA甲基化测序检测方法“甲状腺癌甲基化捕获”(thyroid-cancer-methylation-capture,ThyMet),主要用于测量血液中甲状腺乳头状癌特异性DNA甲基化标志物水平,旨在以非侵入性的手段对甲状腺乳头状癌分类。该研究通过开发基于靶向甲基化测序的 panel,训练一个包含6个标志物分类器(classifier),包括[ACTRT2(-231,544)和 MMEL1(-142,073)]、[ACTRT2 (-231,552)和MMEL1 (-142,065)]、[RIN1 (-519)]、[SLC4A10 (-200,384)和TBR1 (+7,947)]、[ETV5 (-146,955)和DGKG (+106,170)]、[ETV5 (-146,929)和DGKG (+106,196)],结果显示与超声分级相比,其对甲状腺乳头状癌与良性结节的鉴别具有更高的特异度(0.722 vs 0.625),同时具有较高的敏感度(0.809 vs 1.000),AUC为0.828。而且该研究显示,ThyMet和超声分级的组合分类器进一步提高了甲状腺乳头状癌血浆分类的准确性,AUC 提高到 0.923,灵敏度达0.957,特异度为0.708。已有研究表明ThyMet和超声检查存在互补关系,因此未来通过结合ctDNA甲基化和超声检查,可能更精确地鉴别甲状腺结节的良恶性性质,从而为临床治疗选择提供更有力的依据。
2.2 基于外周血单核细胞的肿瘤甲基化标志物
在直肠癌研究中,国内学者XIE等报道了一种基于DNA甲基化的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)检测方法,其通过微阵列、焦磷酸测序和靶向双硫仑测序分析结直肠癌患者和健康对照组PBMCs的全基因组甲基化景观,发现了5个可用于结直肠癌诊断的DNA甲基化标志物(cg11754974、cg24906336、cg22678228、cg26026551和cg00227790)。该研究还特别针对早期结直肠癌建立了一种单管多重甲基化特异性定量PCR检测方法(multiple methylation-specific quantitative PCR assay,multi-msqPCR),用于同时检测5个DNA甲基化标志物,该法允许对少至0.1% 的PBMC DNA样本进行定量分析,并且比单分子检测具有更好的鉴别性能。然后,基于甲基化标志物和multi-msqPCR方法构建了一个结直肠癌诊断模型(colorectal cancer diagnostic model,CDM),该模型在早期结直肠癌的诊断效能方面表现出色(AUC为0.91,敏感度为 81.18%,特异度为89.39%),相比传统肿瘤标志物CEA(AUC为0.79)有所改进,此外CDM还能高度鉴别晚期腺瘤病例(AUC为0.85,敏感度为63.04%)。进一步的随访数据表明,CDM较目前临床已有的诊断方法至多提早2年识别出患结直肠癌潜在风险。
类似的,利用乳腺癌患者的PBMCs,也有研究鉴定出了4个乳腺癌特异性DNA甲基化标志物,分别是cg16652347、cg13828440、cg11754974和cg18637238。还有研究也基于这4个DNA甲基化标志物开发了一种高效方便的多重甲基化特异性定量PCR检测方法,在多中心队列中验证其诊断性能,发现其能区分早期乳腺癌患者和正常对照组,诊断AUC达0.940,敏感度及特异度分别为93.2%和90.4%,而且这种检测方法的性能超过了现有的临床诊断手段,特别是在检测早期和微小肿瘤方面。
2023年,DNA甲基化标志物的研究给我们带来很多惊喜,基于DNA甲基化发生在肿瘤超早期和离体后性质稳定等特性,各种早期诊断的工具蓬勃发展,检测的组织来源既有传统的实体肿瘤组织液,也有少量的血液,更有无创的体液检测,甚至“变废为宝”,利用废弃卫生棉条进行检测,无疑为我们展示了一种逐渐无创化的研发趋势。同时,DNA甲基化标志物的“标志”意义也不再局限于肿瘤的早期检测,还囊括了肿瘤术后的MRD检测、术后的随访监测等,从而提供了更多的临床意义。此外,目前不同研究团队的DNA甲基化标志物使用思路也各有千秋,从单一癌种使用复杂的标志物panel到单一癌种使用单一或几个标志物,甚至有单一标志物诊断多种癌种的出现,这些研究说明DNA甲基化肿瘤标志物在癌症诊断和基因表达调控研究等方面具有广泛的应用前景,有望为癌症早期诊断和研究带来革命性的变化。

目前表观遗传学的发展方兴未艾,DNA甲基化标志物的研究更是如火如荼,未来可能继续深入研究DNA甲基化的调控机制,探索不同DNA甲基化状态下的肿瘤发生、发展和治疗耐药性等方面的差异;在技术层面上,开发新的甲基化检测技术和方法,以提高DNA甲基化标志物检测的特异性和灵敏度;开发新型的机器学习和深度学习算法,并将其应用于新的 DNA 甲基化数据以预测潜在的甲基化标志物,协助从复杂的生物医学数据中快速地识别和分析与DNA甲基化标志物相关的特征。与此同时,多学科团队之间的紧密协作也正积极推动实验室成果向临床应用的转化,从而利用甲基化数据进行临床诊断和个体化治疗,借助表观遗传学方法改进癌症患者的临床治疗,为癌症患者带来福音。



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根据孟德尔遗传定律(亲子鉴定的理论基础),孩子身上的遗传物质一半来自于生物学父亲(简称“生父”),一半来自于生物学母亲(简称“生母”),每个基因座上的两个等位基因也分别来自生父和生母。DNA亲子鉴定就是根据科学技术将子女的DNA信息与父亲、母亲的DNA信息相比对,如果符合即是亲生关系,不符则非亲生。

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